uu.seUppsala universitets publikationer
Ändra sökning
RefereraExporteraLänk till posten
Permanent länk

Direktlänk
Referera
Referensformat
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association
  • vancouver
  • Annat format
Fler format
Språk
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Annat språk
Fler språk
Utmatningsformat
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Structure-guided approach to site-specific fluorophore labeling of the lac repressor LacI
Uppsala universitet, Teknisk-naturvetenskapliga vetenskapsområdet, Biologiska sektionen, Institutionen för cell- och molekylärbiologi. Uppsala universitet, Science for Life Laboratory, SciLifeLab.
Uppsala universitet, Science for Life Laboratory, SciLifeLab. Uppsala universitet, Teknisk-naturvetenskapliga vetenskapsområdet, Biologiska sektionen, Institutionen för cell- och molekylärbiologi.
Uppsala universitet, Teknisk-naturvetenskapliga vetenskapsområdet, Biologiska sektionen, Institutionen för cell- och molekylärbiologi, Molekylär systembiologi. Uppsala universitet, Science for Life Laboratory, SciLifeLab.
Uppsala universitet, Teknisk-naturvetenskapliga vetenskapsområdet, Biologiska sektionen, Institutionen för cell- och molekylärbiologi. Uppsala universitet, Science for Life Laboratory, SciLifeLab.
Visa övriga samt affilieringar
2018 (Engelska)Ingår i: PLoS ONE, ISSN 1932-6203, E-ISSN 1932-6203, Vol. 13, nr 6, artikel-id e0198416Artikel i tidskrift (Refereegranskat) Published
Abstract [en]

The lactose operon repressor protein LacI has long served as a paradigm of the bacterial transcription factors. However, the mechanisms whereby LacI rapidly locates its cognate binding site on the bacterial chromosome are still elusive. Single-molecule fluorescence imaging approaches are well suited for the study of these mechanisms but rely on a functionally compatible fluorescence labeling of LacI. Particularly attractive for protein fluorescence labeling are synthetic fluorophores due to their small size and favorable photophysical characteristics. Synthetic fluorophores are often conjugated to natively occurring cysteine residues using maleimide chemistry. For a site-specific and functionally compatible labeling with maleimide fluorophores, the target protein often needs to be redesigned to remove unwanted native cysteines and to introduce cysteines at locations better suited for fluorophore attachment. Biochemical screens can then be employed to probe for the functional activity of the redesigned protein both before and after dye labeling. Here, we report a mutagenesis- based redesign of LacI to enable a functionally compatible labeling with maleimide fluorophores. To provide an easily accessible labeling site in LacI, we introduced a single cysteine residue at position 28 in the DNA-binding headpiece of LacI and replaced two native cysteines with alanines where derivatization with bulky substituents is known to compromise the protein's activity. We find that the redesigned LacI retains a robust activity in vitro and in vivo, provided that the third native cysteine at position 281 is retained in LacI. In a total internal reflection microscopy assay, we observed individual Cy3-labeled LacI molecules bound to immobilized DNA harboring the cognate O-1 operator sequence, indicating that the dye-labeled LacI is functionally active. We have thus been able to generate a functional fluorescently labeled LacI that can be used to unravel mechanistic details of LacI target search at the single molecule level.

Ort, förlag, år, upplaga, sidor
PUBLIC LIBRARY SCIENCE , 2018. Vol. 13, nr 6, artikel-id e0198416
Nationell ämneskategori
Biokemi och molekylärbiologi
Identifikatorer
URN: urn:nbn:se:uu:diva-358704DOI: 10.1371/journal.pone.0198416ISI: 000433900800119PubMedID: 29856839OAI: oai:DiVA.org:uu-358704DiVA, id: diva2:1243367
Forskningsfinansiär
EU, Europeiska forskningsrådet, 714068Vetenskapsrådet, VR 2015-04568Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse, WAF 2014.0183EU, Europeiska forskningsrådet
Anmärkning

De tre första författarna delar förstaförfattarskapet.

Tillgänglig från: 2018-08-31 Skapad: 2018-08-31 Senast uppdaterad: 2018-08-31Bibliografiskt granskad

Open Access i DiVA

fulltext(4488 kB)62 nedladdningar
Filinformation
Filnamn FULLTEXT01.pdfFilstorlek 4488 kBChecksumma SHA-512
3fad3908dad6d1e1af1b9195d98fe1dcf13781e88db3686c38d7607516af122a3a897cd2ec051ed4890c519938411bf7b9208dcb19dcf9d39e7dd4055379b850
Typ fulltextMimetyp application/pdf

Övriga länkar

Förlagets fulltextPubMed

Personposter BETA

Marklund, EmilTubasum, SumeraMao, GuanzhongLehmann, Laura ChristinaElf, JohanDeindl, Sebastian

Sök vidare i DiVA

Av författaren/redaktören
Marklund, EmilTubasum, SumeraMao, GuanzhongLehmann, Laura ChristinaElf, JohanDeindl, Sebastian
Av organisationen
Institutionen för cell- och molekylärbiologiScience for Life Laboratory, SciLifeLabMolekylär systembiologiMolekylärbiologi
I samma tidskrift
PLoS ONE
Biokemi och molekylärbiologi

Sök vidare utanför DiVA

GoogleGoogle Scholar
Totalt: 62 nedladdningar
Antalet nedladdningar är summan av nedladdningar för alla fulltexter. Det kan inkludera t.ex tidigare versioner som nu inte längre är tillgängliga.

doi
pubmed
urn-nbn

Altmetricpoäng

doi
pubmed
urn-nbn
Totalt: 220 träffar
RefereraExporteraLänk till posten
Permanent länk

Direktlänk
Referera
Referensformat
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association
  • vancouver
  • Annat format
Fler format
Språk
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Annat språk
Fler språk
Utmatningsformat
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf